Os microscópios confocais de varredura a laser são usados para pesquisas com diversos espécimes vivos e fixados em estudos moleculares e celulares anatômicos, fisiológicos e bioquímicos em ciências da vida. A capacidade inata de segmentar a luz opticamente permite que os microscópios de varredura a laser realizem uma reconstrução precisa de estruturas 3D com alta resolução e alto contraste a partir de uma série de imagens obtidas em diferentes profundidades.
Para saber mais sobre o uso da microscopia confocal, acesse nosso centro de recursos para microscopia.

A microscopia confocal oferece diversas vantagens em relação à microscopia óptica de campo amplo, entre elas a capacidade de controlar a profundidade do campo, a eliminação ou redução das informações de fundo para longe do plano focal (alta proporção entre sinal e ruído), além da capacidade de coletar cortes ópticos em série de espécimes espessos. O elemento básico para a abordagem confocal é o uso de técnicas de filtragem espacial visando eliminar a luz ou reflexo fora do foco em espécimes fora do campo de visão imediato.

Um microscópio confocal a laser de varredura de pontos cria cortes ópticos de um espécime mediante o escaneamento ponto a ponto de um laser focado em um campo de visão. Em seguida, a objetiva do microscópio focaliza essa luz na amostra. Os fótons emitidos pelos fluoróforos na amostra localizada no ponto de foco são coletados pela objetiva e retransmitidos de volta pelo escâner, passando por um pinhole que é conjugado ao plano focal da objetiva, fazendo com que somente os fótons no foco sejam detectados pelo tubo fotomultiplicador. Ao obter imagens dos fótons em cada ponto da posição do laser, é possível reconstruir uma imagem píxel por píxel.

Para saber mais sobre a microscopia confocal, acesse nosso centro de recursos para microscopia.

A microscopia multifotônica é uma excelente técnica para a formação de imagem profunda em espécimes espessos, principalmente durante experimentos in vivo. Os pulsos de laser no infravermelho próximo fortemente focados penetram mais profundamente nos tecidos biológicos do que a luz visível, pois o infravermelho próximo passa por menos absorção e dispersão. Para a formação de imagem, o laser pulsado passa por uma varredura pelo espécime, normalmente usando os comprimentos de onda de 700 a 1.300 nm para excitação. A excitação multifotônica está intrinsecamente localizada no plano focal, o que reduz a fototoxicidade. E o que é mais importante, não é necessário usar um pinhole confocal para a segmentação óptica, sendo possível coletar mais sinal de luz, incluindo fótons dispersos de fluorescência. Os resultados são imagens 3D detalhadas e com brilho em profundidade de espécimes espessos.

Descubra o microscópio de varredura a laser multifotônica Olympus FVMPE-RS™.

Em geral, a resolução é significativamente melhor na microscopia confocal em relação às técnicas tradicionais de microscopia de campo amplo. Como a resolução na microscopia de varredura a laser depende da abertura numérica (AN) da objetiva, é essencial usar objetivas com alta AN para atingir uma imagem de alta resolução. A Evident oferece um pacote de objetivas com alta abertura numérica (AN), incluindo as objetivas X Line™, que proporciona alta AN, nivelamento da imagem e correção cromática para melhorar a resolução da imagem em um campo de visão mais amplo. Para a formação de imagem profunda em tecidos, as objetivas de imersão em silicone A Line™ fornecem um índice de refração próximo ao de células vivas, viabilizando uma formação de imagem 3D mais clara e com resolução mais alta com o mínimo de aberração esférica.

Para uma resolução aprimorada durante a formação de imagem em profundidade com nosso sistema multifotônico FVMPE-RS, as objetivas TruResolution™ têm um colar automatizado de correção que faz a compensação dinâmica da aberração esférica enquanto mantém uma posição precisa do foco. Elas se ajustam automaticamente em cada plano de uma imagem de volume, gerando imagens 3D mais nítidas e claras em profundidade.

Para remover o embaçamento a fim de produzir imagens mais claras e nítidas em alta resolução durante o processamento de imagem, a Olympus desenvolveu os algoritmos TruSight™ especializados em deconvolução 2D e 3D para imagens confocais a laser e Super Resolução Olympus (Olympus Super Resolution, OSR).

Para estudos que exigem resoluções mais altas, como análise de colocalização, o módulo de formação de imagem Super Resolução Olympus (Olympus Super Resolution, OSR) para o sistema FV3000 é capaz de adquirir 4 sinais fluorescentes de modo sequencial ou simultâneo com uma resolução lateral (X-Y) de aproximadamente 120 nm, praticamente o dobro da resolução de microscópios confocais comuns.

O microscópio FV3000 da série FLUOVIEW™ pode ser usado com diversas objetivas de aumento, desde uma objetiva de baixa ampliação (1,25X) até uma objetiva de alta ampliação (150X), dependendo da aplicação. Objetivas de baixa ampliação de 1,25X a 4X são adequadas para a captura da estrutura de todo o tecido. Para capturar a morfologia das células que compõem o tecido, utiliza-se objetivas de ampliação média entre 10X e 40X. Para capturar a microestrutura dentro das células, normalmente se utiliza objetivas de alta ampliação (60X). A ampliação óptica pode melhorar ainda mais o aumento da imagem, alcançando até 50 vezes mais o nível de aumento da objetiva mediante a diminuição do ângulo do espelho de escaneamento.

É possível configurar os microscópios de varredura a laser em um sistema de acordo com seu orçamento e aplicação. Se você tiver um objeto limitado que deseja observar, é possível limitar o número de lasers, detectores e tipos de objetivas por um preço acessível. Também é possível aprimorar o sistema adicionando as unidades necessárias conforme seus objetivos de pesquisa mudem e avancem com o passar do tempo.

Entre em contato com seu representante local da Evident para conversar sobre nossos sistemas confocais de varredura a laser e receber uma cotação.